High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) เป็นเทคนิค “Chromatography” แยกสารที่มีประสิทธิภาพสูงและเป็นที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ทั้งในงานวิจัยและในอุตสาหกรรมต่างๆ HPLC สามารถแยกสารผสมที่ซับซ้อนออกเป็นองค์ประกอบย่อยได้อย่างรวดเร็ว แม่นยำ และมีความไวสูง จึงเหมาะสำหรับการวิเคราะห์สารที่มีปริมาณน้อย สารที่ไม่เสถียร หรือสารที่มีโครงสร้างโมเลกุลขนาดใหญ่อย่างเช่นโปรตีนและสารชีวโมเลกุลต่างๆ
HPLC คือ
HPLC เป็นเทคนิค “Chromatography” ชนิดหนึ่งที่ใช้ของเหลวเป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ (Mobile phase) และอาศัยการไหลของวัฏภาคเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ที่บรรจุตัวดูดซับซึ่งเป็นวัฏภาคคงที่ (Stationary phase) ภายใต้ความดันสูง สารผสมจะละลายในวัฏภาคเคลื่อนที่และถูกพาเข้าสู่คอลัมน์ สารแต่ละชนิดในสารผสมจะมีอันตรกิริยากับวัฏภาคคงที่แตกต่างกัน ทำให้มีอัตราการเคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ไม่เท่ากัน ส่งผลให้เกิดการแยกออกจากกันเป็นแถบหรือพีค สารที่ออกมาจากคอลัมน์จะถูกตรวจวัดด้วยเครื่องตรวจวัดและบันทึกผลในรูปกราฟที่เรียกว่า “โครมาโทแกรม (Chromatogram)”
กลไกการแยกสารใน HPLC
การแยกสาร “Chromatography” ใน HPLC เกิดจากความสัมพันธ์ระหว่างสารกับวัฏภาคสองชนิดภายในคอลัมน์ วัฏภาคคงที่มักเป็นอนุภาคของแข็งขนาดเล็กที่มีพื้นผิวสูง เช่น ซิลิกา หรือ อนุภาครูพรุนของพอลิเมอร์ ซึ่งอาจเคลือบด้วยสารเคมีเพื่อเพิ่มความจำเพาะกับสารบางชนิด ส่วนวัฏภาคเคลื่อนที่เป็นตัวทำละลายที่ใช้ชะสารให้เคลื่อนที่ผ่านคอลัมน์ อันตรกิริยาระหว่างสารกับสองวัฏภาคอาจเป็นแบบแรงไฮโดรโฟบิค แรงไฟฟ้าสถิต พันธะไฮโดรเจน หรือแรงแวนเดอร์วาลส์ สารที่มีอันตรกิริยาแรงกับวัฏภาคคงที่จะเคลื่อนที่ช้ากว่าสารที่มีอันตรกิริยาอ่อน ความแตกต่างในอัตราการเคลื่อนที่นี้จึงนำไปสู่การแยกสารผสมออกจากกันได้
ชนิดของคอลัมน์ใน HPLC
คอลัมน์เป็นหัวใจของระบบ HPLC มีหลากหลายชนิดให้เลือกใช้ตามคุณสมบัติของสารที่ต้องการวิเคราะห์ สามารถแบ่งได้ตามลักษณะของวัฏภาคคงที่ดังนี้
- Normal phase ใช้วัฏภาคคงที่ที่มีขั้วสูง เช่น ซิลิกา และวัฏภาคเคลื่อนที่ที่ไม่มีขั้วหรือมีขั้วน้อย เช่น เฮกเซน เหมาะสำหรับแยกสารไม่มีขั้วหรือมีขั้วน้อย
- Reversed phase ใช้วัฏภาคคงที่ที่ไม่มีขั้ว เช่น ซิลิกาที่เคลือบด้วย C18 และวัฏภาคเคลื่อนที่ที่มีขั้ว เช่น น้ำผสมอะซีโทไนไตรล์ เหมาะสำหรับแยกสารมีขั้วปานกลางถึงสูง
- Ion-exchange ใช้วัฏภาคคงที่ที่มีกลุ่มแลกเปลี่ยนไอออน เช่น กลุ่มซัลโฟเนต สำหรับแยกสารที่มีประจุ เช่น กรดอะมิโน โปรตีน
- Size-exclusion ใช้วัฏภาคคงที่ที่เป็นเจลรูพรุนสำหรับแยกสารตามขนาดโมเลกุล เช่น การแยกสารพอลิเมอร์ โปรตีน
การเตรียมตัวอย่างสำหรับ HPLC
ก่อนนำเข้าสู่ระบบ “Chromatography” แบบ HPLC สารตัวอย่างต้องมีความบริสุทธิ์สูงและอยู่ในรูปที่พร้อมสำหรับการฉีด ขั้นตอนในการเตรียมมีดังนี้
- การสกัด ใช้เทคนิคต่างๆ เช่น การสกัดด้วยตัวทำละลาย (Solvent extraction) การสกัดแบบของแข็ง (Solid-phase extraction) เพื่อสกัดสารออกจากเนื้อเยื่อหรือวัสดุตัวอย่าง
- การกำจัดสารรบกวน นำสารสกัดมาผ่านกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีเช่น การตกตะกอนโปรตีนด้วยสารเคมี การกรอง การปั่นเหวี่ยง เพื่อกำจัดสารรบกวนที่อาจมีผลต่อการวิเคราะห์
- การเจือจาง ในกรณีที่สารมีความเข้มข้นสูง ให้เจือจางสารด้วยตัวทำละลายที่เหมาะสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่เหมาะสมกับช่วงการวัดของเครื่อง HPLC
- การทำให้เป็นเนื้อเดียว ผสมสารให้เข้ากันด้วยเครื่องผสมแบบ Vortex หรือการใช้คลื่นอัลตราโซนิก เพื่อให้ตัวอย่างมีความสม่ำเสมอ ป้องกันการอุดตันในระบบ HPLC
- การกรอง กรองสารด้วยแผ่นกรองขนาดรูพรุนเล็กประมาณ 0.45 ไมโครเมตร ก่อนนำเข้าสู่ขวดตัวอย่างและฉีดเข้าเครื่อง HPLC
การประยุกต์ใช้ HPLC ในด้านต่างๆ
HPLC เป็นเทคนิค “Chromatography” ที่อเนกประสงค์ สามารถใช้ในการแยก ตรวจวัด และวิเคราะห์สารได้อย่างกว้างขวางในหลายสาขา เช่น
- การวิเคราะห์ยาและสารออกฤทธิ์ วิเคราะห์ปริมาณยาและสารตกค้างในเภสัชภัณฑ์และตัวอย่างชีวภาพ เพื่อควบคุมคุณภาพและประสิทธิภาพของยา
- งานนิติวิทยาศาสตร์ ตรวจสอบสารเสพติดและสารพิษในของกลางหรือตัวอย่างที่เกี่ยวข้องกับอาชญากรรม
- การวิเคราะห์ด้านอาหาร หาปริมาณสารอาหาร วิตามิน รวมถึงสารเติมแต่งและสารปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์อาหาร เพื่อประเมินคุณค่าทางโภชนาการและความปลอดภัย
- การวิเคราะห์ด้านสิ่งแวดล้อม ตรวจวัดสารพิษ ยาฆ่าแมลง และสารมลพิษอื่นๆ ในตัวอย่างดิน น้ำ และอากาศ เพื่อตรวจสอบผลกระทบต่อระบบนิเวศและสุขภาพ
- งานวิจัยทางชีวเคมีและชีววิทยา ศึกษาเมแทบอลิซึมของสิ่งมีชีวิต โดยติดตามการเปลี่ยนแปลงของสารชีวโมเลกุลต่างๆ ภายในเซลล์หรือเนื้อเยื่อ
การพัฒนาเทคโนโลยี “Chromatography” ของ HPLC ในปัจจุบันทำให้สามารถแยกสารได้รวดเร็วขึ้น ใช้ปริมาณสารน้อยลง และเพิ่มความไวในการตรวจวัด การเชื่อมต่อ HPLC กับเครื่องมือวิเคราะห์แบบอื่น เช่น Mass spectrometer ยังช่วยขยายขอบเขตการใช้งานให้กว้างขวางขึ้น HPLC จึงเป็นเทคนิคที่ทรงพลังและจะยังคงมีบทบาทสำคัญในงานวิเคราะห์ทางเคมีต่อไปในอนาคต